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Immunhistochemischer Nachweis TH enthaltender Zellen:

Fixieren: Die entnommenen Gehirne werden für 24h in 4%iger PFA Lösung eingelegt. Anschließend werden sie in 4%ige PFA Lösung + 30% Sacharose umgebettet.

Schneiden: Gefrierschnitte im Kryostaten (-18 bis –20°C) mit einer Schnittdicke von 20-30µm. Die Schnitte werden aus 4, 8 oder 10 Schnittserien aufgeteilt. Diejenigen Schnittserien die direkt gefärbt werden sollen, werden in 0.1M PB Lösung aufbewahrt. Die andere Schnittserien werden in Antifreeze Lösung bei –20°C gelagete.

TH Färbung: Die Färbung wird in kleinen Plastikgefäßen mit Hilfe der „free floating technique“ durchgeführt. Je Kästchen wird eine Füllmenge von 1ml angenommen und je eine Schnittserie auf 2 Kästchen verteilt.

1. Waschen 3* waschen mit 01.M PB Puffer

2. Peroxidase Blockierung Ansatz für 10 Kästchen: 1ml Methanol 1ml H2O2 30% 8ml 0.1M PB Puffer

15 min inkubieren

3. Waschen 3* waschen mit 01.M PB Puffer

4. Präinkubation: Ansatz für 10 Kästchen: 0.5ml Normal Horse Serum NHS (Vector S-2000) 9.5ml Triton / PB = (100ml 0.1M PB Puffer + 300µl Triton) Lösung filtrieren!

60 min inkubieren

5. TH Antikörper: (Anti thyrosin hydroxylase made in mouse (Boeringer Mannheim, Art. NR. 1017381) Aliquotierung: 40mg in 1.6ml auqa dest lösen à in 0.1ml Aniquots einfrieren)

Ansatz für 10 Kästchen: 0.2ml NHS 9.5ml Triton / PB Lösung filtrieren! 0.1ml TH-Antikörper (= 1:40 Endkonzentration)

über Nacht bei 4°C inkubieren

6. Waschen 3* waschen mit 01.M PB Puffer

7. Sekundär Anitkörper (Anti mouse IgG, made in horse biotinyliert von Vector, BA-2000) Aliquotierung: 1.5mg in 1.5ml auqa dest lösen à in 0.1ml Aniquots einfrieren)

Ansatz für 10 Kästchen: 10ml Triton / PB 05µl anti mouse IgG

60 min inkubieren

8. Waschen 3* waschen mit 01.M PB Puffer